LA TÉCNICA DE LA PCR (INTRODUCCIÓN Y PRINCIPIOS BÁSICOS)

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Principios básicos sobre PCR

La técnica de PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction) es un proceso basado en el uso de la enzima Taq ADN polimerasa para amplificar regiones de ADN. De esta manera se aumenta la cantidad de dichas regiones en la muestra para su consecuente estudio o uso en una gran variedad de ensayos.

Para la PCR estándar, todo lo que se necesita es una polimerasa de ADN, magnesio, nucleótidos (dNTPs), primers, el template de ADN a amplificar y un termociclador.

El mecanismo de PCR es tan simple como su propósito:
1) El ADN de doble cadena se desnaturaliza por calor (desnaturalización)
2) Los primers se alinean (hibridación) con las hebras individuales de ADN
3) Los primers se extienden por la ADN polimerasa (elongación), lo que da como resultado dos copias de la hebra de ADN original

La PCR es un método muy sensible y se requieren volúmenes muy pequeños para reacciones individuales.
Se recomienda preparar una mezcla maestra (master mix) para varias reacciones. La master mix debe mezclarse bien y luego dividirse por el número de reacciones, asegurándose de que cada reacción contenga la misma cantidad de enzima, dNTP y primers.

Hot Start PCR

La amplificación inespecífica, es decir, la amplificación de regiones del ADN que no son de interés, es un problema que puede ocurrir durante la PCR.

La mayoría de las polimerasas de ADN que se utilizan para PCR funcionan mejor entre 68 y 72 ºC. Por lo tanto, la temperatura de elongación elegida debe estar en este rango. Sin embargo, la enzima también se puede activar a menor temperatura. A temperaturas muy por debajo de la temperatura de alineamiento/hibridación, los primers tienden a unirse de forma no específica, lo que puede dar lugar a una amplificación inespecífica. Esto se puede evitar mediante el uso de las denominadas Taq polimerasas Hot Start.

Estas polimerasas contienen un inhibidor unido a ellas que previene su activación. Una vez se alcanza la temperatura  óptima para el proceso de elongación este inhibidor se disocia y así la enzima puede llevar a cabo su función.

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